產品簡介：

原位雜交（in situ hybridization，ISH）是在一定生物結構基礎之上的核酸雜交。這種結構基礎可以是一條染色體；一個細菌；更大結構基礎是細胞和組織。基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子，應用帶有標記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生-物素、地-高辛等非放射性物質）DNA或RNA 片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交， 然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位。本產品就是用于原位雜交的雜交液。

產品特點：

1.即開即用，不用用戶自己購買原料配制和優化配方。

2.有很高的敏感性和特異性（跟探針設計，雜交溫度等密切相關）。

3.既可以用于RNA原位雜交、DNA原位雜交，也可以用于熒光原位雜交

（FISH）。

4.如果使用Oligo探針進行原位雜交，則需要購買另外的產品：核酸雜交液

（Oligo探針專用）

5.本產品只能用于科研。

產品參數：

成分規格包裝材料

高效核酸雜交液（原位雜交專用）

10 mL10 mL 本色瓶

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸和-20℃保存、有效期一年。

自備試劑

蓋玻片、多聚甲醛等。

使用方法：

以檢測mRNA 序列的切片原位雜交為例。

一、培養細胞和冰凍切片的原位雜交

1.玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES處理撥片。切片厚度10-20μm。

2.細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘× 3次。

3.培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：用4%多聚甲醛固定液（in 0.1 M RNase-free PBS，pH7.2-7.6）室溫固定30分鐘，用蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。

4.將30%H2O2 和純甲醇按1：50的比例混合，然后用此混合液室溫處理細胞

30分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗滌3次。

5.暴露mRNA核酸片段：在切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃-蛋白酶（1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃-蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化5-120秒鐘

6.用PBS洗3次×5分鐘，蒸餾水洗1次。

7.用4%多聚甲醛固定液（in 0.1 M RNase-free PBS，pH7.2-7.6）再室溫固定10分鐘，然后蒸餾水洗滌3次。如果使用胃-蛋白酶消化才需要再固定這一步。

8.預雜交：在雜交盒底部加20%甘油20mL以保持濕度。按每張切片加20μL預雜交液。恒溫箱38-42℃放置2-4小時。吸棄多余雜交液，不用洗切片。

9.靶分子的變性。靶分子為mRNA，故可以跳過此步。如果為DNA的則必須變性。將探針溶液加到切片上，蓋上蓋玻片，80℃烘箱變放置10 min，冷卻至37℃后進入下一步。

10.雜交：每張切片加20μL核酸雜交液（原位雜交專用），蓋上原位雜交專用蓋玻片，放恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。

11.雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，用37℃預熱的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5

×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

12.滴加封閉液，37℃放置30分鐘。甩去多余封閉液，不洗。

13.根據探針標記物，選擇相應顯色方法顯色、復染，脫水、封片。

14.結果觀察。石蠟切片

如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。

固定液選擇 4%多聚甲醛（in 0.1 M PBS，pH7.0-7.6）。標本較大時用刀片切成厚度不超過 4mm 的小塊，固定 1 小時即可。較大的標本固定不要超過 2 小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間 30-40 分鐘，一般不要

超過 1 小時。

15.常規脫水、浸蠟、包埋、切片。切片厚度在6-8μm。

16.玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES預先處理。

17.石蠟切片經常規脫蠟至水。將30%H2O2 和蒸餾水的1：10混合液加到切片上，室溫放置10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。

18.暴露mRNA核酸片段：在切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃-蛋白酶（1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃-蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化3-30分鐘（視標本新舊、厚薄自行調整）。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10 分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到最佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×  5分鐘。蒸餾水洗1次。

19.其余步驟同冰凍切片（第1節第6-11步相同。

選擇我們的高效核酸雜交液（原位雜交專用），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！