產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

miRNA 純化試劑盒（過(guò)柱法）是用于小 RNA 分離純化產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.一步法直接分離純化小 RNA，比兩步法（先分離總 RNA 和再純化其中的小 RNA）和 PAGE 電泳回收法更簡(jiǎn)單。得到的小 RNA 長(zhǎng)度大部分在 200 nt 以下，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA等。

2.柱式操作，整個(gè)過(guò)程只需要 10 多分鐘。

3.適用范圍廣，可以用于動(dòng)物組織、血液及部分植物組織等實(shí)驗(yàn)材料。

4.得到的小 RNA 純度高，OD260/280 一般都在 1.9 以上。

5.產(chǎn)率一般為 20-40 μg/100 mg 動(dòng)物組織。

6.無(wú)基因組 DNA 的污染。

7.可用于 RT-PCR、miRNA 標(biāo)記、microarray 等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝材料

miRNA 純化溶液 A25 mL30 mL 棕色玻璃瓶

miRNA 純化溶液 B25 mL30 mL 本色瓶

miRNA 純化溶液 C50 mL60 mL 本色瓶

離心吸附柱50 套×2塑料袋

miRNA 專用洗柱液50 mL60 mL 本色瓶

RNA 洗脫液10 mL10 mL 本色瓶

使用手冊(cè)1 份1 份

運(yùn)輸及保存

常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。

自備試劑

氯仿。

使用方法：

由于離心吸附柱的吸附量限制，本產(chǎn)品每次提取只能處理 100 mg 左右的各種組織。如果處理樣品量大，請(qǐng)分成很多相當(dāng)于微量提取的量進(jìn)行，最后再收集在一起。

1.  新鮮配制裂解液。將 miRNA 純化溶液 A 和 miRNA 純化溶液 B 按 1:1 的比例混合，然后根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同分為下面及種情況使用。注意：miRNA 純化溶液 A 和 miRNA 純化溶液 B 混合后必須立即使用，不要放置，否則會(huì)產(chǎn)生沉淀。

a)對(duì)貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，在每 10 平方厘米細(xì)胞中加入 1 mL 新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。

b)對(duì)懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每 1-5×106 懸浮細(xì)胞中加入 1 mL

新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。如果是 fibroblasts

或 carcinoma cell，1 mL 新鮮配制的裂解液的細(xì)胞使用量不要超過(guò) 1×106個(gè)細(xì)胞。

c)對(duì)新鮮的動(dòng)物或植物實(shí)體組織：勻漿法：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入 10 mL 或 15 mL 塑料離心管中，每 50-100 mg 組織加 1 mL 新鮮配制的裂解液，用剪切式勻漿機(jī)勻漿 30 秒左右。對(duì)肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），建議組織的使用量不要超過(guò) 50 mg/mL 裂解液，否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染。液氮研磨法：將組織在液氮中研磨成粉，然后轉(zhuǎn)移到新配制的裂解液中，震蕩混勻。

d)對(duì)在 RNA 非凍型保存液中保存的動(dòng)物或植物實(shí)體組織組織：先用紙吸去保存液后再剪切成小塊，再按新鮮實(shí)體組織的處理方法處理。

2. 將裂解物轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，然后加入 0.2 倍體積的自備氯仿(1 mL 裂解物需 0.2 mL 氯仿)，振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。

3. 14,000×g 室溫離心 3-5 分鐘。

4.將上清液（約 0.6-0.8 mL）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。注意：離心后下層有機(jī)相和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險(xiǎn)起見(jiàn)，可以留下 100 μL 上清液不取。同時(shí)吸取上清時(shí)最好緩慢進(jìn)行，否則容易吸出交界面的不可見(jiàn)的絲狀 DNA。

5.14,000×g 室溫離心半分鐘，收集管中的穿透液。大 RNA 及 DNA 將與離心吸附柱的膜結(jié)合，小 RNA 將存在于穿透液中。但由于離心吸附柱的最大吸附能力為 40 μg 動(dòng)物 RNA，20 μg 植物 RNA，所以如果樣品中的大 RNA 含量高于上面數(shù)值，則需要減少上樣量，否則穿透液中將同時(shí)含有大 RNA 和小 RNA。

6.在最后得到的不含大 RNA 的穿透液中加等體積的 miRNA 純化溶液 C，混勻。此時(shí)溶液的總體積約 1.5 mL。

7.先轉(zhuǎn)移約 0.75 mL 到離心吸附柱中，14,000×g 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

8.將上步上柱剩余的樣品轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，14,000×g 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

9.加 0.7 mL miRNA 專用洗柱液到離心吸附柱中，14,000×g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

10.加 0.3 mL miRNA 專用洗柱液到離心吸附柱中，14,000×g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。此步一般可以省略。

11.14,000×g 室溫離心半分鐘以甩出殘聯(lián)液體。此步十分重要，否則殘留的miRNA 專用洗柱液會(huì)影響 miRNA 的使用。

12.將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的RNase-free 收集管中，加入 50 μL RNA 洗脫液，室溫放置 3-5 分鐘。

13.14,000×g 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 miRNA 樣品，可以立即使用

或存放于-80℃待用。

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