產品簡介：

本產品是基于蛋白質鹽析和透析原理開發的非變性蛋白質濃縮產品。其原理  是將大量具有很強水化能力的硫酸銨加到蛋白質溶液中，奪取蛋白質分子的水化層（龍其是蛋白質表面非極性區的水化層），使之“失水"，于是蛋白質分子間的非極性基團將互相結合，使蛋白質形成沉淀，離心分離沉淀后，再用透析方法將  蛋白質中的鹽除去，即得濃縮的蛋白質。

產品特點：

1.一站式，包涵鹽析和透析所需的成分，用戶只需提供所需沉淀的蛋白。

2.適用于大多數蛋白，是否適用于某種具體的蛋白，需要預先實驗。

3.非變性法，不會破壞蛋白質的天然結構和活性，尤其是適用于對變性敏感的  酶溶液。

4.得到的蛋白質結構穩定，適合于長期保存。

5.非變性法蛋白沉淀試劑盒只能用于科研。

產品參數：

成分規格包裝

非變性法蛋白沉淀溶液 A50 mL×1060 mL 本色瓶

去離子水50 mL60 mL 本色瓶

0.5M EDTA 溶液0.5 mL1.5 mL 白蓋管

使用手冊1 份無

運輸及保存

常溫運輸和保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑

透析液

使用方法：

注意：除對溫度敏感的蛋白質樣品需在 4℃環境下（如冷室）操作外，一般可在室溫中操作，操作者整個操作須戴好手套。

一：鹽析沉淀

1.測量待濃縮蛋白質樣品的體積，并將其轉移到容積至少是樣品體積兩到三倍  的無菌燒杯或玻璃三角瓶中。注意：需要處理的蛋白質樣品最好溶解在 pH 為中性的緩沖液中（如 50 mM 的 Tris-HCl），濃度最好在 1mg/mL 以上。

2.將一個無菌的磁力攪拌子放入三角瓶中，再將三角瓶放置在磁力攪拌器上，  打開開關后緩慢攪拌。注意：攪拌過程中不能產生泡沫。

3.如果待濃縮蛋白容易被金屬離子失活或抑制，則最好加入 EDTA 溶液，使其終濃度為 10 mM，否則此步可省略。

4.小心緩慢加入所需的非變性法蛋白沉淀溶液 A（以下簡稱“溶液 A"，注意用前需要搖勻），再將溶液 A 和蛋白溶液按 1:1 的比例緩慢混合（具體操作時最好每次少量加入，切莫一下倒入，否則蛋白質容易變性）。混合過程中，  蛋白質沉淀可能會使溶液呈牛奶狀，屬于正常現象。不要增加溶液 A 的使用比例，否則溶液比重過大，難以在后面的離心中把蛋白質沉淀下來。

5.將所需溶液 A 全部加入后，冰上放置 60 分鐘或過夜讓蛋白質充分沉淀。注意：血紅蛋白、肌紅蛋白和清蛋白等在較高的溫度 25℃比在 0℃度時溶解度低，更容易鹽析，所以濃縮這些樣品時冰浴放置可以改為室溫放置。有的蛋  白質 15-20 分鐘就可以完-全沉淀，有的則需要數小時。

6.將溶液輕移到旋蓋塑料離心管或離心瓶中，在平衡條件下 15000×g 4℃離心15 分鐘。注意：溶液比重很大，一定要重量上平衡而非體積平衡。

7.小心棄上清，得到蛋白質沉淀。此沉淀可以在 4℃放置數月。

8.將盡可能少的無菌水或其他緩沖液加入蛋白質沉淀中使之溶解，所加體積一  般是沉淀物體積的 1-2 倍。如果沉淀溶解后非常粘稠，可以適當補加無菌水使其變得不粘稠。此沉淀可以在 4℃放置幾天。

9.如果溶液中有不溶物（主要是變性的蛋白質），可以 15000×g 4℃離心 15 分鐘，留上清。

10.上清液可以用于 SDS-PAGE 電泳檢測或 UV 法蛋白質濃度測定。

11.如果后續純化方法是疏水層析或排阻層析，則不需要將溶液中殘留的鹽去  掉，可以直接使用。如果后續純化是離子交換層析，則需要將溶液中殘留的  鹽去掉，一般采用透析法，具體操作見附一。

附一：透析脫鹽

1.將蛋白溶液轉移到一端已經封口的透析袋內，預留一些液體膨脹的空間，然  后將另一端封口。注意：用戶需要預處理透析袋，預處理的方法是將透析袋  在含 2%（W/V）碳酸-氫鈉和 1 mM EDTA 的溶液中煮沸 10 分鐘，用蒸餾水徹-底清洗透析袋，然后放在 1 mM EDTA 的溶液中煮沸 10 分鐘并浸沒在此溶液中冷卻，最后放 4℃保存待用。取用時必須要戴手套。

2.將透析袋放置在裝有透析液的容器中，透析液的體積必須是蛋白質溶液的20-100 倍，溶液最好處于攪拌狀態。用戶可以用適合后續實驗的任何緩沖液作為透析液。每次透析 3-4 小時，共透析 2-3 次。可以用自備的萘氏試劑檢測透析袋外面溶液是否還有殘留的銨離子來檢測透析是否完成。

3.將透析后的溶液全部轉移到離心管中，15000×g 4℃離心 15 分鐘，上清液即為濃縮后的蛋白溶液。可以放-80℃冰箱保存或立即用于后續的實驗。

4.如果需要快速測定蛋白質的濃度，可取少許樣品作適當倍數稀釋后，用紫外分光光計測 280nm 和 260nm 的光吸收，再計算其濃度，計算公式為：蛋白濃度(mg/mL)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×樣品稀釋度。

附二：多克隆抗體的濃縮

1.將待處理的血清樣品在 4℃或室溫 20000×g 離心 30 分鐘，收集上清。

2.取上清 20mL 與等體積的自備生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加 40 mL 非變性法蛋白沉淀溶液 A。注意：加等量生理鹽水的目的是將蛋白質含量降低到 2.5-3.0%，否則其他蛋白質會跟抗體一起共沉淀。

3.冰上放置 30 分鐘以上或過夜，使蛋白質充分沉淀。

4.將溶液轉移到旋蓋塑料離心管中，15000×g 4℃離心 10 分鐘，棄上清。

5.用 12 mL 自備生理鹽水溶解蛋白質沉淀。

6.于攪拌下緩慢滴加 8 mL 溶液 A，冰上放置 1 小時使蛋白充分沉淀。

7.將溶液轉移到旋蓋塑料離心管中，15000×g 4℃離心 10 分鐘，棄上清。

8.用 13.3 mL 生理鹽水溶解蛋白質沉淀。

9.于攪拌下緩慢滴加 6.6 mL 溶液 A，冰上放置 1 小時使蛋白充分沉淀。

10.將溶液輕移到旋蓋塑料離心管中，15000×g 4℃離心 10 分鐘，棄上清。

11.用少許生理鹽水溶解蛋白質沉淀，并轉移

到透析袋中。

12.用大于 20-100 倍體積的PBS 于 4℃對蛋白質溶液進行透析，更換透析液數次， 然后讓蛋白質溶液置-80℃保存或用其他方法進一步純化。

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