產品簡介：

菌落 PCR 是篩選重組子的有效方法，可以使質粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時。但如果宿主是酵母，其菌落 PCR 的難點則是破壁，因為酵母的細胞壁比細菌堅韌許多。本產品是基于玻璃珠破壁方法而開發的酵母菌落 PCR 產品。

產品特點：

1.破壁效率高，甚至可以用于野生型酵母。

2.既可用酵母菌落，也可用酵母培養液。

3.條件溫和，菌落 PCR 可以擴增長達 3 kb 的 DNA。

4.既可小規模篩選，也適用于大規模篩查。

5.高靈敏度，既可用于擴增酵母質粒，也可以用于擴增酵母基因組 DNA。

6.PCR 反應液中含有惰性電泳染料，反應后可直接上樣電泳，不需另加上樣液。

7.處理過的酵母菌落樣品低溫長期保存后仍能用于 PCR 篩查。

8.酵母菌落PCR試劑盒足夠 100 次 60 μL 體系的酵母菌落 PCR（細菌菌落 PCR 需要用另一款產品）。

產品參數：

成份 規格包裝

酵母破壁液 2×1 mL1.5 mL 綠蓋管

2×PCR MasterMix

（菌落篩選專用） 2×1.5 mL1.5 mL 紅蓋管

酸洗玻璃珠400-600 μm 3 g2.0 mL 本色管

使用手冊 1 份1 份

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。

自備試劑

酵母菌落，模版專一性引物，TE 緩沖液。

使用方法：

一、 酵母破壁

1.如果有 N 個樣本，則標記 N+2 個 1.5 mL 的塑料離心管，N 個用于樣本， 一個用于陽性對照 PC（Positive Control，確認有質粒陽性的樣本），一個用于陰性對照 NC（Negative Control，可以用水代替）。

2.在每個管中加入 20 μL 酵母破壁液。

3.挑入一個新鮮酵母菌落（芝麻大小即可）或 2 μL 酵母飽和菌液。

4.加入體積跟酵母破壁液相當的酸洗玻璃珠（重量在 20-30 mg）。

5.渦旋震蕩 3 分鐘。

6.常溫 10000 rpm 離心半分鐘后可以直接取上清作為模板立即進行 PCR。如果不立即進行PCR，需將上清全部轉移到新離心管中（至少可以取出 15 μL），再加入等體積的自備 TE 緩沖液，放-20℃待用。TE 緩沖液中的 EDTA 可以抑制樣本中殘留 DNase 的活性，可以使 DNA 的放置時間更長。

二、PCR 擴增

7. 在一個 1.5 mL 的預冷塑料離心管中分別加入下列預冷成份并充分混勻 ， 得到 PCR 預混液并放冰上待用。由于有 N+2 個樣本，所以配制時多加一個， 按 N+3 計算：

7.將上步得到的預冷 PCR 預混液按 59 μL/管分裝到 N+2 個標記并且預冷的 PCR 管中。

8.將第 6 步制備的N+2 個樣品各取 1 μL 加入上步加有 59 μL 混合液的 PCR管中。PC 樣到 PC 管，NC 樣到 NC 管，1 號樣品加入到 1 號 PCR 管中，以此類推。由于裂解液含大量 PCR 抑制物，樣本用量不要超過 1.5 μL，否則樣本加得越多，PCR 越容易被抑制。

9.將 N+2 個預冷的 PCR 管快速放入 PCR 儀器中進行擴增，PCR 溫度參數根據引物和模板情況由客戶自己預先確定。

10.PCR 結束后直接取 10 μL 電泳直接進行瓊脂糖電泳分析。本試劑盒提供的 PCR MasterMix（菌落篩選專用）中已經含有電泳示蹤劑和促沉劑，故可以直接上樣。橙黃色電泳染料的泳動速度對應于 50 bp 的 DNA，藍色電泳染料的泳動速度對應于 3-5 kb 的 DNA。

11.如果陰性對照 NC 有預期大小的擴增產物，則無論陽性對照 PC 和 N 個樣本的結果如何，整個實驗無效。說明環境污染，需要解決污染問題再繼續。  如果陽性對照 PC 沒有預期大小的片段，且沒有任何樣本呈現陽性，則很可能是試劑、程序、引物、儀器等有問題，需要解決問題后再繼續。如果有任 何一個樣本呈現陽性（不包括陰性對照），則實驗有效，可以繼續分析每個樣  品。

12.如果陽性對照有預期大小的片段，陰性對照沒有，則整個實驗有效。可以分析每個樣品。每個樣品如果有預期大小的擴增產物，則初步判斷為陽性。  如果沒有，則判斷為陰性。

13.對陰性樣本，可以用超純水將其稀釋 10 倍、百倍、千倍、萬倍 4 個稀釋度， 然后一起再進行 PCR 檢測，如果某個稀釋度的樣本出現預期擴增產物，則測試時需要先將樣本稀釋到該稀釋度后再測。

14.可以將陽性樣品對應的菌落再挑出來進行培養并進行進一步的分析。

選擇我們的酵母菌落PCR試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！